Cy3 NHS酯(脂溶性)

产品货号：

KM0202

中文名称：

Cy3 NHS酯(脂溶性)

英文名称：

Cyanine3 NHS Ester

产品规格：

1mg|5mg

发货周期：

1～3天

产品价格：

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Cyanine3是一种脂溶性的，橘黄色发射波长的荧光染料。Cyanine3 NHS Ester是Cyanine3的胺反应性活化酯，用于标记生物分子的氨基基团。非常适合用于标记可溶性蛋白，多肽，和寡核苷酸/DNA。

基本信息

分子式：C₃₅H₄₂IN₃O₄
分子量：695.64g/mol
纯度：≥95%
外观：红色粉末或固体
溶解性：溶于DMF，DMSO，不溶于水
Ex/Em：~548/562nm
消光系数：150,000L·mol^-1·cm^-1
A280/Amax：8%
光谱相似染料：Alexa Fluor 555,DyLight 555
结构式：
Cy3 NHS酯(脂溶性)

保存：-20℃干燥避光，有效期2年。

背景资料

花菁类染料（Cyanine Dyes）是一种在两个氮原子间含聚亚甲基桥键且携带一非定域电荷的分子，花菁素具有极其高的消光系数通常高于100,000L·mol^-1·cm^-1。不同的替代基允许控制发光团的性能比如吸光波长，光稳定性和荧光强度。例如，通过选择不同长度的聚亚甲基桥键能够控制吸光和荧光波长：花菁素越长，吸光和发射波长更高，高达至近红外区。

在生命科学领域广受欢迎的花菁类染料由美国卡耐基梅隆大学的Alan Waggoner教授和同事于二十世纪90年代早期研发应用。这些染料呈现出低的生物分子非特异性结合，并由其巨大的消光系数和良好的量子产量产生明亮的荧光。目前商业化可提供各种反应性衍生物，比如点击化学用的N-羟基琥珀酰亚胺酯，马来酰亚胺，叠氮化物和其他衍生物。目前花菁染料常以两种异构体的形式供应：一种非磺化的花菁类染料和磺化的花菁类染料，对于许多应用，两种是可以互相替换的，因其光谱属性基本相同。两种染料都可用于DNA和蛋白质等生物分子的标记。两者的区别在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水环境中标记，无需有机共溶剂，且在水中不易聚集。

Cyanine3 NHS Ester是脂溶性的，先用有机溶剂如DMSO，DMF配制成母液后，再加入水溶性反应溶液内。纯有机溶剂的母液置于-20℃避光保存，最好2周内用完，避免反复冻融。水溶性反应液必须现配现用，尽快用完。
Cy染料和生物分子的比例（F/P）=4～12之间荧光强度最高。F/P过高，荧光探针会自我淬灭并且影响生物分子的活性。CyDye NHS在pH8.5～9.4内标记抗体10min，F/P可达5~6。但在pH7.0内几乎无反应。我司内部使用Cy3NHS标记Anti-GST抗体发现按1:1，1:5，1:10，和1:20标记得到的F/P分别为0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

一、水溶性Cy3 NHS标记Anti-GST抗体
其它Cyanine Dye NHS参考此方法进行并做适当摸索。

商业化购买的抗体如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明胶等），或溶于带氨基的缓冲液，会影响标记。需在标记前对抗体进行纯化。
于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST（0.5mL，3mg/ml），室温或4℃透析4h。
换用1L新鲜的0.15M NaCl溶液，4℃透析过夜。
第二天再换用1L 0.1M NaHCO3（pH8.3），4℃透析4h。
【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
用0.1M NaHCO3（pH8.3）稀释少量的抗体，于280nm测其紫外吸收值并计算标记抗体的总量（IgG抗体摩尔吸光系数为170,000 at 280nm）。
用DMSO配制Cy3 NHS（Mw:765.95），浓度为10mg/ml。根据CyDye NHS和抗体的使用比值（比如1:20）来计算所需要染料的体积。然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时于暗处低速搅拌，室温45min。
用1L 0.15M NaCl溶液，常温或4℃避光透析4h，以除去未标记上的Cy3 NHS。
换用新鲜的1L 0.15M NaCl溶液，4℃避光透析过夜。
换用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室温或4℃避光透析4h，然后在4℃避光再次透析过夜。
【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整数倍稀释标记抗体，测定280nm（蛋白）和552nm（Cy3）处的紫外可见吸光度。
产品冷冻干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中，-20℃避光保存。
F/P计算：
Cy3在552nm下的摩尔吸光系数为150,000L·mol^-1·cm^-1，此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000L·mol^-1·cm^-1，不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy3本身在280nm处的吸收是552nm处的8%。按照以下公式计算F/P值。
[Cy3] = A₅₅₂/150000;
[Antibody] =[A₂₈₀-(0.08×A₅₅₂)]/170000
F/P_final =[Cy3]/[Antibody]= [1.13×A₅₅₂]/[A₂₈₀-(0.08×A₅₅₂)]

二、水溶性Cy5 NHS标记（D-ser2）- Leu-Enkephalin
其它CyDye NHS参考此方法进行并做适当摸索。

低温保存的Cy5 NHS置于室温回温至少20min。往1mg粉末内加入400μL高品质无水DMSO充分溶解。同样，低温保存的玻璃瓶装的（D-ser2）- Leu-Enkephalin（0.75mg）室温回温后加入400μL高品质无水DMSO充分溶解。将400μL Cy5 NHS加入400μL多肽内。
注：染料与多肽通常质量比1:1。
再加入15μL三乙胺，常温避光搅拌反应混合物，过夜。
注：若多肽稳定性较弱，则于4℃反应过夜。
用HPLC纯度多肽。使用C18柱子（25cm×10mm），每次上样注入2×400μL，30min梯度洗脱从0.1% TFA水溶液到MeCN:H2O (0.1% TFA)=70:30，流速4mL/min。（对不同的多肽选择不同的合适HPLC梯度流动相）
收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
产品冷冻干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要时可用质谱表征。
CyDye标记的蛋白/多肽稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4℃可避光保存2月，更长保存需加入等体积甘油-20℃避光保存。
F/P计算：
Cy5在650nm下的摩尔吸光系数为250,000L·mol^-1·cm^-1，此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000L·mol^-1·cm^-1，不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy5本身在280nm处的吸收是650nm处的5%。按照以下公式计算F/P值。
[Cy5] = A₆₅₀/250000;
[Peptide] =[A₂₈₀-(0.05×A₆₅₀)]/170000
F/P_final =[Cy5]/[Peptide]= [0.68×A₆₅₀]/[A₂₈₀-(0.05×A₆₅₀)]

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