产品货号:
KM0202
中文名称:
Cy3 NHS酯(脂溶性)
英文名称:
Cyanine3 NHS Ester
产品规格:
1mg|5mg
发货周期:
1~3天
产品价格:
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Cyanine3是一种脂溶性的,橘黄色发射波长的荧光染料。Cyanine3 NHS Ester是Cyanine3的胺反应性活化酯,用于标记生物分子的氨基基团。非常适合用于标记可溶性蛋白,多肽,和寡核苷酸/DNA。
分子式:C35H42IN3O4
分子量:695.64g/mol
纯度:≥95%
外观:红色粉末或固体
溶解性:溶于DMF,DMSO,不溶于水
Ex/Em:~548/562nm
消光系数:150,000L·mol-1·cm-1
A280/Amax:8%
光谱相似染料:Alexa Fluor 555,DyLight 555
结构式:
保存:-20℃干燥避光,有效期2年。
一、水溶性Cy3 NHS标记Anti-GST抗体
其它Cyanine Dye NHS参考此方法进行并做适当摸索。
二、水溶性Cy5 NHS标记(D-ser2)- Leu-Enkephalin
其它CyDye NHS参考此方法进行并做适当摸索。
相关搜索:Cy3 NHS酯(脂溶性),脂溶性Cy3-NHS,Cy3琥珀酰亚胺酯,Cyanine3 SE,Cyanine3 NHS Ester
分子式:C35H42IN3O4
分子量:695.64g/mol
纯度:≥95%
外观:红色粉末或固体
溶解性:溶于DMF,DMSO,不溶于水
Ex/Em:~548/562nm
消光系数:150,000L·mol-1·cm-1
A280/Amax:8%
光谱相似染料:Alexa Fluor 555,DyLight 555
结构式:
保存:-20℃干燥避光,有效期2年。
花菁类染料(Cyanine Dyes)是一种在两个氮原子间含聚亚甲基桥键且携带一非定域电荷的分子,花菁素具有极其高的消光系数通常高于100,000L·mol-1·cm-1。不同的替代基允许控制发光团的性能比如吸光波长,光稳定性和荧光强度。例如,通过选择不同长度的聚亚甲基桥键能够控制吸光和荧光波长:花菁素越长,吸光和发射波长更高,高达至近红外区。
在生命科学领域广受欢迎的花菁类染料由美国卡耐基梅隆大学的Alan Waggoner教授和同事于二十世纪90年代早期研发应用。这些染料呈现出低的生物分子非特异性结合,并由其巨大的消光系数和良好的量子产量产生明亮的荧光。目前商业化可提供各种反应性衍生物,比如点击化学用的N-羟基琥珀酰亚胺酯,马来酰亚胺,叠氮化物和其他衍生物。目前花菁染料常以两种异构体的形式供应:一种非磺化的花菁类染料和磺化的花菁类染料,对于许多应用,两种是可以互相替换的,因其光谱属性基本相同。两种染料都可用于DNA和蛋白质等生物分子的标记。两者的区别在于溶解度:磺化染料具水溶性,可以在水环境中标记,无需有机共溶剂,且在水中不易聚集。
- Cyanine3 NHS Ester是脂溶性的,先用有机溶剂如DMSO,DMF配制成母液后,再加入水溶性反应溶液内。纯有机溶剂的母液置于-20℃避光保存,最好2周内用完,避免反复冻融。水溶性反应液必须现配现用,尽快用完。
- Cy染料和生物分子的比例(F/P)=4~12之间荧光强度最高。F/P过高,荧光探针会自我淬灭并且影响生物分子的活性。CyDye NHS在pH8.5~9.4内标记抗体10min,F/P可达5~6。但在pH7.0内几乎无反应。我司内部使用Cy3NHS标记Anti-GST抗体发现按1:1,1:5,1:10,和1:20标记得到的F/P分别为0.28:1,1.16:1,2.3:1和4.6:1。
一、水溶性Cy3 NHS标记Anti-GST抗体
其它Cyanine Dye NHS参考此方法进行并做适当摸索。
- 商业化购买的抗体如果含有其他蛋白(如血清白蛋白,明胶等),或溶于带氨基的缓冲液,会影响标记。需在标记前对抗体进行纯化。
- 于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST(0.5mL,3mg/ml),室温或4℃透析4h。
- 换用1L新鲜的0.15M NaCl溶液,4℃透析过夜。
- 第二天再换用1L 0.1M NaHCO3(pH8.3),4℃透析4h。
- 【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
- 用0.1M NaHCO3(pH8.3)稀释少量的抗体,于280nm测其紫外吸收值并计算标记抗体的总量(IgG抗体摩尔吸光系数为170,000 at 280nm)。
- 用DMSO配制Cy3 NHS(Mw:765.95),浓度为10mg/ml。根据CyDye NHS和抗体的使用比值(比如1:20)来计算所需要染料的体积。然后慢慢将其加入到抗体溶液中,同时于暗处低速搅拌,室温45min。
- 用1L 0.15M NaCl溶液,常温或4℃避光透析4h,以除去未标记上的Cy3 NHS。
- 换用新鲜的1L 0.15M NaCl溶液,4℃避光透析过夜。
- 换用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室温或4℃避光透析4h,然后在4℃避光再次透析过夜。
- 【可选】用0.22μm低吸附滤膜过滤透析后的抗体溶液。
- 用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整数倍稀释标记抗体,测定280nm(蛋白)和552nm(Cy3)处的紫外可见吸光度。
- 产品冷冻干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中,-20℃避光保存。
- F/P计算:
Cy3在552nm下的摩尔吸光系数为150,000L·mol-1·cm-1,此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000L·mol-1·cm-1,不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy3本身在280nm处的吸收是552nm处的8%。按照以下公式计算F/P值。
[Cy3] = A552/150000;
[Antibody] =[A280-(0.08×A552)]/170000
F/Pfinal =[Cy3]/[Antibody]= [1.13×A552]/[A280-(0.08×A552)]
二、水溶性Cy5 NHS标记(D-ser2)- Leu-Enkephalin
其它CyDye NHS参考此方法进行并做适当摸索。
- 低温保存的Cy5 NHS置于室温回温至少20min。往1mg粉末内加入400μL高品质无水DMSO充分溶解。同样,低温保存的玻璃瓶装的(D-ser2)- Leu-Enkephalin(0.75mg)室温回温后加入400μL高品质无水DMSO充分溶解。将400μL Cy5 NHS加入400μL多肽内。
注:染料与多肽通常质量比1:1。 - 再加入15μL三乙胺,常温避光搅拌反应混合物,过夜。
注:若多肽稳定性较弱,则于4℃反应过夜。 - 用HPLC纯度多肽。使用C18柱子(25cm×10mm),每次上样注入2×400μL,30min梯度洗脱从0.1% TFA水溶液到MeCN:H2O (0.1% TFA)=70:30,流速4mL/min。(对不同的多肽选择不同的合适HPLC梯度流动相)
- 收集适当的色带峰,标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
- 产品冷冻干燥成粉末或置于水溶液中,-20℃避光保存。必要时可用质谱表征。
- CyDye标记的蛋白/多肽稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4℃可避光保存2月,更长保存需加入等体积甘油-20℃避光保存。
- F/P计算:
Cy5在650nm下的摩尔吸光系数为250,000L·mol-1·cm-1,此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170,000L·mol-1·cm-1,不同蛋白的摩尔吸光系数不同。Cy5本身在280nm处的吸收是650nm处的5%。按照以下公式计算F/P值。
[Cy5] = A650/250000;
[Peptide] =[A280-(0.05×A650)]/170000
F/Pfinal =[Cy5]/[Peptide]= [0.68×A650]/[A280-(0.05×A650)]
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